Проработка исследований о связи эндометриоза и полиморфизма гена KRAS

Эндометриоз характеризуется наличием эндометриальных тканей вне полости матки. Данная патология затрагивает 6-10% женщин фертильного возраста и проявляется выраженными болями, дисменореей, аномальными маточными кровотечениями, а также бесплодием.

У 50% женщин бесплодие сопровождается эндометриозом. Проявления заболевания могут отличаться или полностью отсутствовать. В этом случае диагноз выставляется при рутинном обследовании, когда проводится диагностика иной гинекологической патологии. В некоторых случаях постановка правильного диагноза может откладываться на долгие годы.

Несмотря на то, что для лечения заболевания используется ряд лекарственных препаратов, в том числе оральные контрацептивы, прогестины, агонисты гонадотропин-рилизинг гормона. Медикаментозная терапия часто не дает положительного эффекта. В 36% случаев после проведения хирургического лечения, требуется повторная операция.

Обследовано 2077 человек

Такая неоднородность клинической картины и расхождений в результатах терапии, может быть связана с различными фенотипическими вариантами заболевания. Изучение всех этих вариантов необходимо для индивидуализации лечения и достижения оптимальных результатов.

Хотя генетическая предрасположенность к эндометриозу несомненно имеет место, только предстоит определить гены, ответственные за данное заболевание. Проведенное в естественных условиях исследование модели спонтанного мышечного эндометриоза показало, что активация онкогенного гена KRAS в поверхностном эпителии яичников мыши привело к образованию новых очагов эндометриоза. В результате этого было предложено, что активация данного пути может играть роль в формировании данной патологии у людей. Однако, данная теория пока еще не была подтверждена у женщин методом мутационного анализа.

МикроРНК — небольшие молекулы РНК, которые отвечают за посттранскрипционную экспрессию генов. Они связываются с UTR на целевом мессенджере РНК и приводят к снижению трансляции белков. Let-7 семейство микроРНК подавляет трансляцию KRAS. Специфический однонуклеотидный полиморфизм, в котором происходит нуклеотидная замена аллелей, является фактором риска для немелкоклеточного рака легких, рака яичников и рака груди. Предполагалось, что данное изменение ухудшает прогноз течения заболевания, усиливая риск метастазирования. Однако, эта теория не подтвердилась.

Основываясь на имеющихся данных о влиянии KRAS, мы выдвинули гипотезу о том, что он может влиять на развитие эндометриоза. В нашем исследовании было обнаружено, что 31% (41 из 132) проанализированных пациентов с гистологически доказанным эндометриозом имеет дефект в гене KRAS, что значительно превышает среднее значение в здоровой популяции. Кроме того, эндометриоз, ассоциированный с дефектом данного гена характеризовался более высокой скоростью распространения очагов. Однако, в других исследовательских группах не удалось выявить такой закономерности. Подобные исследования проводились в 2010 году в Японии и в 2011 году в Европе.

Ввиду противоречивых результатов было решено произвести оценку частоты встречаемости дефекта в гене KRAS у пациентов с эндометриозом. Исследование проводилось по методике случай-контроля. Определялся фактор является ли дефект данного гена одной из причин формирования эндометриоза или он маркер заболевания, которое устойчиво к медикаментозной терапии.

Материалы и методы

Был проведен сбор данных у 2077 женщин, которые прошли лапароскопию по поводу бесплодия и отсутствия болевого синдрома с января 1993 года по февраль 2010 года. Все пациенты перенесли оперативное лечение и дали письменное согласие на проведение вмешательства.

Были собраны образцы крови и проведена биопсия. В исследовании изучались женщины с эндометриозом всех степеней тяжести, выставленных согласно американской классификации. В тех случаях, когда был выявлен эндометриоз, проводилась хирургическая абляция или резекция. Данное исследование было одобрено комитетом по этике больницы Лювена, а также Каролинского института.

Экстракция ДНК

Как говорилось ранее, для проведения рутинного обследования, проводился сбор ДНК из ЭДТА-стабилизированной крови. Исследование проводилось на базе университетских клиник, Лёвена, Бельгия. Использовались следующие методы: Chemagic DNA, Auto Pure LS, Purgene. Выбор метода экстракции основывался на количестве собранной крови, а также метода ее забора.

ДНК, полученная при биопсии, изучалась с использованием QIAGEN QIAmp DNA, согласно протоколу. Концентрация ДНК измерялась при помощи NanoDrop 1000. Также, в некоторых случаях использовалась очистка фенолом.

Генетическое тестирование

Для высокопроизводительного генотипирования, выделенные образцы ДНК амплифицировались с использованием анализа полимеразной цепной реакции TaqMan, разработанной специально для аллеля Т или G гена KRAS. Работа была выполнена в MiraDx, в одобренной CLIA лаборатории, использующей KRAS-вариантный аллель.

Статистический анализ

Анализ данных выполнялся с использованием IBM SPSS. Тест хи-квадрат использовался для анализа данных аллелей. Для сравнения интервальных данных применялся тест ANOVA и Т-тест. Статистическая значимость — p < 0.05.

Результаты

Характеристики группы

В общей сложности было обследовано 2077 субъектов, которые перенесли лапароскопическое вмешательство по поводу бесплодия. Около 90% обследуемых являлись европейскими кавказцами. Для большинства операция была первичной. Всего 1140 женщинам было проведено гистологическое обследование, в то время как у 937 оно отсутствовало. Диагноз бесплодия был зарегистрирован в 1071 медицинской записи.

Овуляция, имплантация, трубные и генетические проблемы были выявлены в 9,5%, 1,4%, 5,6% и 0,3% случаев соответственно в группе с подтвержденным эндометриозом и 20,2%, 3,5%, 24,9% и 1% в группе без лапароскопического подтверждения диагноза. В 83% случаев с эндометриозом, бесплодие было классифицировано, как беспричинное.

По стадиям эндометриоза, процентное соотношение было следующим: 1 стадия — 34,4%, 2 стадия — 21,3%, 3 стадия — 16,5%, 4 стадия — 26,5%. Около 1,1% не имели выставленной стадии заболевания. Средний AFS балл для всех пациентов с эндометриозом составил 29±33,6. Бесплодие чаще диагностировалось у курящих субъектов, чем у некурящих.

Частота G и Т аллелей в LCS6 на 3’UTR в гене KRAS

Во всей проанализированной популяции, ген Т типа был обнаружен у 1756 человек (84,5%), смешанный вариант (TG ген), встречался у 308 пациентов (14,8%), чистый G вариант в 8,04% случаев.

В итоге, для получения достоверной разницы между контрольными группами, нами было проанализировано всего 316 аллелей. Всего же в исследовании, анализу подверглось 4154 аллели.

Сравнение пациентов с эндометриозом и без него, несущего оба варианта аллеля в гене KRAS

Частота первичного и вторичного бесплодия у пациентов с диагностированным эндометриозом или без него, не отличались, независимо от наличия аллелей G и Т типа. В тех случаях, когда была известна причина бесплодия, вариант аллеля не был связан с индивидуальной этиологией.

Все четыре группы, обследуемых имели одинаковый ИМТ, и приблизительно одинаковый возраст во время проведения оперативного вмешательства. В итоге, варианты аллелей не имели никакой связи ни с ИМТ, ни с возрастом.

Обсуждение

В предыдущем исследовании было обнаружено, что 31% пациентов с умеренным и тяжелым эндометриозом подвергаются хирургическому лечению для снятия болевого синдрома после отсутствия эффекта от медикаментозной терапии. Нами было предположено, что полиморфизм генов может быть связан со степенью тяжести заболевания и играет роль в его формировании.

Однако, дальнейшие проведенные исследования по этому вопросу, не подтвердили повышенную частоту вариантных аллелей при эндометриозе. В данном исследовании был включен в список большее количество больных для проведения статистического анализа. В итоге определено, что частота данного аллеля составляет приблизительно 8%, что подтверждает проведенные ранее исследования.

В итоге не выявили повышенную частоту вариантных аллелей с эндометриозом. К сожалению, в данном исследовании не смогли проверить связь гена KRAS с другими проявлениями эндометриоза, такими как боль или кровотечения, поскольку проводилась выборка исключительно по пациентам с бесплодием, а остальные проявления заболевания не были задокументированы в большинстве случаев.

В итоге, в нашей статье мы пытались найти полиморфизм связанный именно с бесплодием, а не с хронической болью и нарушениями месячного цикла. В обоих исследования использовался один и тот же метод определения полиморфизма, поэтому вероятность ошибки сведена к минимуму.

В большинстве случаев, которые мы исследовали, до операции не проводилась медикаментозная терапия, поэтому сложно оценивать ее эффективность. Мы предполагаем, что наличие специфический аллелей в гене KRAS не является признаком предрасположенности к заболевания, а скорее маркером устойчивости его к медицинскому лечению.

Наше исследование показывает, что KRAS вариант нельзя считать маркером предрасположенности к эндометриозу в европейской популяции. В итоге, в патогенезе KRAS-ассоциированного варианта эндометриоза остается много вопросов. В нашем исследовании мы показали, что у пациентов с эндометриозом, уровень экспрессия мРНК гена KRAS, значительно усиливалась в сравнении со здоровой популяцией.

Учитывая появление новых данных, можно с уверенностью говорить, что KRAS ген играет большую роль при эндометриозе, однако это требует дальнейших клинических исследований.

Список литературы:

1. Giudice LC. Clinical practice. Endometriosis. N Engl J Med. 2010 Jun; 362(25): 2389–98.
2. Giudice LC, Kao LC. Endometriosis. Lancet. 2004 Nov; 364(9447): 1789–99.
3. Eskenazi B, Warner ML. Epidemiology of endometriosis. Obstet Gynecol Clin North Am. 1997 Jun; 24(2): 235–58.
4. ПабМед: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/31185482
5. Macer ML, Taylor HS. Endometriosis and infertility: a review of the pathogenesis and treatment of endometriosis-associated infertility. Obstet Gynecol Clin North Am. 2012 Dec; 39(4): 535–49.
6. Hudelist G, Fritzer N, Thomas A, Niehues C, Oppelt P, Haas D, et al. Diagnostic delay for endometriosis in Austria and Germany: causes and possible consequences. Hum Reprod. 2012 Dec; 27(12): 3412–6.
7. Brosens I, Gordts S, Benagiano G. Endometriosis in adolescents is a hidden, progressive and severe disease that deserves attention, not just compassion. Hum Reprod. 2013 Aug; 28(8): 2026–31.
8. Abbott JA, Hawe J, Clayton RD, Garry R. The effects and effectiveness of laparoscopic excision of endometriosis: a prospective study with 2-5 year follow-up. Hum Reprod. 2003
Sep; 18(9): 1922–7.
9.Guo SW. Recurrence of endometriosis and its control. Hum Reprod Update. 2009 Jul-Aug; 15(4): 441–61.
9. Dunselman GA, Vermeulen N, Becker C, Calhaz-Jorge C, D’Hooghe T, De Bie B, et al.; European Society of Human Reproduction and Embryology. ESHRE guideline: management of women with endometriosis. Hum Reprod. 2014 Mar; 29(3): 400–12.
10. Taylor HS, Giudice LC, Lessey BA, Abrao MS, Kotarski J, Archer DF, et al. Treatment of Endometriosis-Associated Pain with Elagolix, an Oral GnRH Antagonist. N Engl J Med. 2017 Jul; 377(1): 28–40.
11. Moen MH, Magnus P. The familial risk of endometriosis. Acta Obstet Gynecol Scand. 1993 Oct; 72(7): 560–4.
12. Dinulescu DM, Ince TA, Quade BJ, Shafer SA, Crowley D, Jacks T. Role of K-ras and Pten in the development of mouse models of endometriosis and endometrioid ovarian cancer. Nat Med. 2005 Jan; 11(1): 63–70.
13. Zhao ZZ, Nyholt DR, Le L, Martin NG, James MR, Treloar SA, et al. KRAS variation and risk of endometriosis. Mol Hum Reprod. 2006 Nov; 12(11): 671–6.